Здравствуй, Хабр! Разработка ингибиторов мутантного онкобелка KRAS ( особенно формы G12D)- одна из главных задач современной онкофармакологии. Используя наш проприетарный матаппарат мы рассчитали несколько секвенсов под целевой карман мишени. Мы оперировали секвенсами от 7 до 21 остатка на мишенях длиной от 102 до 188 остатков, полученные при докинге результаты ipTM в AlfaFold Server варьировались от 0.58 до 0.92.

В качестве демонстрации системы был разработан авторский 14-мерный пептид, нацеленный на карман Switch II белка KRAS G12D ( размер мишени 102 аминокислотных остатка) в комплексе с гуанозинтрифосфатом (ГТФ) и ионом магния.

Результаты BLASTp: проверка на уникальность ( de novo)

Первичный скрининг последовательности через поиск BLASTp ( матрица PAM30 для уникальных коротких последовательностей) подтвердил уникальность структуры. Полных природных аналогов ( гомологов) в протеоме человека нет.

Критически высокий параметр E-value ( равный 37 для ряда находок) доказывает, что эти единичные совпадения-лишь случайный математический шум. Пептид является полностью авторским и получен методом de novo.

Валидация в AlfaFold Server и визуализация в PyMOL(MOLViewer*)

Здесь: на скане выше наш пептид в виде разогнутой скрепки, расположен внизу параллельно спирали и бета листу.

Для проверки пространственной структуры комплекса был иcпользован AlfaFold Server3. Качество интерфейса: алгоритм показал высокую уверенность в стабильности комплекса. Итоговый скор интерфейса (ipTM+pTM) достигал планки для отдельных пептидов до 0.92-0.93 ( в нашем примере значение ipTM 0.90). Для подвижных петель кармана Switch II это высокий уровень, сопоставимый с передовыми разработками.

Геометрия связей ( PyMOL): при анализе структуры в PyMOL не обнаружено стерических столкновений ( clashes). Расстояния между ключевыми атомами пептида и мишени на интерфейсе взаимодействия строго укладываются в физическую норму: от 2.0 до 4.0 Ангстрем. Это подтверждает формирование сильных водородных связей и электростатических контактов (солевых мостиков) с мутантным остатком.

На сканах ниже мишень обозначена коричневым цветом, наш пептид зеленым, ГТФ синим цветом.

На скане видно,как пептид стабильно садится на активную ( связанную с ГТФ) онкоформу белка, блокируя его дальнейший сигнальный каскад. На представленном скане визуализирован интерфейс посадки нашего 14-мера на коровую часть KRAS G12D. Панель измерений (Measurements) справа четко фиксирует сеть прецизионных межмолекулярных контактов в следующих диапазонах: 3.47 Ангстрем( между углеродными атомами боковых цепей CB-CZ)-классический контакт и гидрофобная упаковка; 2.76 Ангстрем ( O-N) и 2.85 Ангстрем ( N-O)- сильные, жесткие водородные связи; 3.10 Ангстрем (O-N) - водородная связь, стабилизирующая положение пептидного остова в кармане мишени.

Полное отсутствие пространственных наложений ( столкновений атомов) при таких близких и энергетически выгодных расстояниях подтверждает точный расчет комплементарности поверхностей.

На втором скане детально показана ключевая особенность посадки: пептид образует прямые прецизионные контакты с молекулой ГТФ, которая находится в каталитическом кармане KRAS. Справа на панели измерений зафиксирована сеть полярных и электростатических взаимодействий: 2.16 Ангстрем (O6-O)- короткая и сильная водородная связь.В биологических молекулах такие расстояния( ~2.1 Ангстрем) указываю на колоссальную энергию связывания и жесткую стабилизацию; 3.10 Ангстрем(O6-OD1) и 3.10 Ангстрем (OD2-N7)- направленные водородные связи с гуаниновым кольцом ГТФ; 3.69 Ангстрем (SG-N1)- координационный или полярный контакт с участием атома серы; 3.82 Ангстрем (CB-OD2)- ван-дер-ваальсово взаимодействие, уплотняющее стык между аминокислотным остовом и кофактором.

Компьютерный дизайн пептидов обычно избегает работы с ГТФ-карманом из-за высокой подвижности и сложности расчета полей, но наши расчеты с этим справились.

Важно отметить, что на данном этапе именно этот дизайн не является строго селективным: в некоторых итерациях с диким белком ( KRAS WT) пептид сохраняет некоторые контакты. Однако другие версии показали высокую селективность, в том числе на более длинных мишенях дикого белка (до 188 остатков).

Данная работа выполнена полностью методами in silico( компьютерное моделирование). Полученные результаты и высокие метрики AlfaFold Server подтверждают стабильность комплекса и точность работы расчетного алгоритма в цифровой среде, однако окончательное подтверждение требует проведения физического синтеза пептида и тестов in vitro и in vivo.

Контакты и поиск партнеров: разработка находится в стадии Pre-clinical Hit высокого уровня уверенности.

Для биоинформатиков, лабораторий и заинтересованных лиц: ищем партнеров для синтеза данного пептида и физического подтверждения константы связывания. Готовы к совместным патентам и публикациям. Возможно обсуждение проведения слепых тестов в случае конструктивной коммуникации. Почта lowtechlab@mail.ru Благодарим за уделенное время и внимание.