В 1980-х годах лаборатория Леонарда Рома обнаружила странный, и, как оказалось, широко распространённый компонент клеток, роль которого неизвестна до сих пор.
Леонард Ром выключает верхний свет в небольшой комнате, и теперь её освещают только монитор компьютера и флуоресцентный экран у основания высоченного электронного микроскопа. Цин Лоу, аспирантка, работающая с биологом из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (UCLA), указывает на несколько овальных пятен в круглой зелёной световой зоне экрана микроскопа. Повернув ручку и щёлкнув мышью, она фокусирует изображение и делает снимок. Десятки, а может, и сотни бочкообразных частиц внезапно заполняют экран компьютера.
«Вот они», — говорит Ром, словно гордый отец, хвастающийся своими детьми.
Это «волты» [vault (англ.) – свод] — загадочные клеточные структуры, которые он и его тогдашняя аспирантка Нэнси Кедерша открыли ещё в 1986 году, когда Ром был молодым отцом с густыми чёрными волосами и усами в стиле Тома Селлека, а Рональд Рейган всё ещё был президентом США.
Как показали он и другие исследователи, волты — это самые массивные частицы, естественным образом образующиеся в клетках человека, и одни из самых распространённых. В большинстве наших клеток насчитывается около 10 000 таких структур, а в некоторых иммунных клетках их количество может достигать 100 000. Многие другие животные тоже их производят. Их обилие — и ресурсы, которые клетки должны вкладывать в их создание — указывает на то, что волты выполняют какую-то важную функцию. Но, несмотря на десятилетия работы Рома и других «волтологов», их назначение остаётся неизвестным. «Это настоящая загадка», — говорит Джоана Видигал, биолог из Национальных институтов здоровья (NIH), которая недавно исследовала роль РНК, обнаруженной внутри волтов.
На протяжении десятилетий выдвигались различные гипотезы — например, что волты помогают переносить вещества внутри клеток или очищать их от токсинов. И одна за другой многообещающие идеи отвергались или теряли актуальность, поскольку подтверждающие доказательства так и не появлялись. Изначально с энтузиазмом отнёсшийся к открытию Рома и Кедерши, NIH потерял интерес к финансированию фундаментальных исследований волтов по мере того, как годы шли, а ответы так и не появлялись. «В моей карьере были периоды, когда я впадал в депрессию», — говорит Ром.
Тем не менее увлечение Рома волтами не угасло, даже когда другие исследователи — в том числе Кедерша — переключились на другие темы. И теперь, при поддержке других спонсоров и лабораторий, он перешёл от фундаментальных исследований волтов к изучению того, как их можно использовать в медицине и других областях в качестве наноразмерных ёмкостей для доставки лекарств и других целей.
Те волты, что в день моего визита мы рассматривали под микроскопом, были получены из генетически модифицированных дрожжей и наполнены иммунной сигнальной молекулой CCL21, которая продемонстрировала способность бороться с опухолями. Компания Vault Pharma, соучредителем которой является Ром и которая работает в инкубаторе при Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе (UCLA), надеется уже в этом году начать клинические испытания на пациентах с раком на поздних стадиях. Это станет первым случаем введения синтетических волтов человеку и, возможно, началом нового витка внимания к этим загадочным органеллам.
Рому сейчас 75 лет, у него трое взрослых сыновей. Его волосы поседели, а впечатляющие усы давно исчезли. Он ушёл на пенсию в 2020 году, но теперь официально вернулся в UCLA на безвозмездной основе — с одним лабораторным столом, одним постдоком и несколькими студентами под своим крылом. (Никто не заметил, что он ушёл, — шутит он, — потому что из-за пандемии COVID-19 все работали из дома.)
В небольшом офисе в Калифорнийском институте наносистем (CNSI) при UCLA, который он помогал проектировать и некоторое время возглавлял, он проводит дни, консультируя другие лаборатории UCLA, а также небольшую команду Vault Pharma по вопросам исследований волтов. Иногда он отвечает на звонки и письма от учёных, впервые узнающих об этих структурах. И Ром по-прежнему налаживает новые сотрудничества. В рамках одного смелого проекта он и лаборатория в Сент-Луисе поместили вирусы в волты в попытке решить серьёзную проблему в генной терапии.
Ему помогает его заразительный энтузиазм. Инженер-эколог из UCLA Шейли Махендра много лет назад стала убеждённой сторонницей капсулирования, наполняя синтетические капсулы ферментами, предназначенными для разложения загрязнителей грунтовых вод. Сейчас она и Ром получают поддержку от фондов и федеральных агентств, чтобы выяснить, помогает ли капсулирование ферментам работать эффективнее и дольше сохранять активность при рассеивании на суше или в воде. «Никто не говорит Ленни „нет“», — смеётся Махендра.
Ром раздумывал, выбирать ли специальность «искусство» или «химия» в бакалавриате, когда его учитель рисования деликатно намекнул, что второе — более практичный вариант. Позже он перешёл на биохимию, которая в то время включала много клеточной биологии. Его первая лаборатория в UCLA частично занималась изучением клеточной структуры: липидных сфер, известных как везикулы, покрытых клатрином. Они транспортируют ферменты к органеллам, называемым лизосомами, помогая расщеплять другие молекулы.
Когда в 1983 году Кедерша присоединилась к группе Рома, она только что закончила докторантуру в Университете Рутгерса, но до этого уже несколько лет работала лаборантом. Они были почти одного возраста и быстро нашли общий язык. Ром поручил ей сравнить везикулы, поступающие в лизосомы, с теми, что из них выходят. Когда она использовала гель для разделения различных видов везикул по их электрическому заряду, она неожиданно увидела дополнительную полосу, указывающую на структуры другого рода. Не сумев их идентифицировать, она попробовала залить свои клеточные препараты красителем на основе тяжёлых металлов, прежде чем рассматривать их под электронным микроскопом.
Словно острова в океане, на фоне лужицы красителя появились белые овальные очертания — волты. Краситель стекал с этих структур, обнажая их форму. Последующие эксперименты показали, что более традиционные красители для липидных мембран, характерных для многих компонентов клетки, не связывались с состоящими исключительно из белков оболочками волтов — это была одна из причин, по которой они так долго оставались неоткрытыми.
В лаборатории был объявлен конкурс на название этих неопознанных клеточных объектов, которые по форме напоминали крошечные американские футбольные мячи. Некоторые предлагали назвать их «гранатами» или «малинами». Популярным вариантом было название «ромесомы», на что Ром быстро ответил «кедершакулы». Но когда аспирантка заметила, что, по её мнению, очертания объектов напоминают сводчатые потолки в соборах, это название прижилось.
По воспоминаниям сотрудников лаборатории, последовал период воодушевления. Некоторые женщины надевали накладные усы, имитирующие усы Рома, и все вместе размышляли над возможными объяснениями того, что они обнаружили. Кедерша обсуждала волты и другие научные вопросы с Ромом во время интенсивных прогулок, которые он совершал, чтобы похудеть. «Мне очень нравилось работать с Ленни», — говорит она.
Всякий раз, когда он встречал другого биолога, он доставал из кошелька микрофотографии волтов, лежавшие рядом с фотографиями его детей, и спрашивал, что тот об этом думает. Один из них предположил, что это заражающий клетки вирус. Поспешный эксперимент опроверг эту версию, но выявил ещё один сюрприз: волты содержали фрагменты РНК, хотя и слишком короткие, чтобы быть вирусным геномом.
Уверенный в том, что лаборатория открыла нечто беспрецедентное, Ром отправил работу в один из ведущих журналов по фундаментальным исследованиям, Cell. Его известный своим категоричным мнением редактор, Бенджамин Левин, отклонил рукопись, не отправив её на рецензию. Журнал с удовольствием пересмотрит решение, добавил он, как только лаборатория определит функцию волтов. Разочарованная команда обратилась в более специализированный журнал по клеточной биологии, и там уже статью быстро опубликовали.
За прошедшие годы лаборатория Рома и ряд других исследовательских групп смогли составить более подробную картину устройства волтов. Несмотря на то, что волт примерно в 10 миллионов раз меньше футбольного мяча, для клетки он всё же остаётся крупным объектом — его масса примерно в три раза превышает массу гораздо более известных рибосом, которые занимаются трансляцией РНК в белки. Каждый волт состоит из 78 копий удлинённого основного белка волта (major vault protein, MVP), расположенных примерно так же, как дуги в бочке. Внутри находятся скопления двух других белков и короткой РНК волта (vRNA).
Гены этих компонентов волта обнаруживаются у различных эукариотических организмов — тех, которые хранят свою ДНК в ядре и обладают другими общими клеточными признаками — за исключением насекомых, растений и грибов. По-видимому, у бактерий их также нет. В исследовании 2013 года было построено генеалогическое древо всех известных организмов, обладающих волтами, и сделан вывод, что они восходят к гипотетическому последнему общему эукариотическому предку, жившему миллиарды лет назад. В ходе эволюции некоторые линии, очевидно, утратили их.
Исходя из их бочкообразной формы, Ром сначала задался вопросом, не переносят ли волты какой-либо полезный груз от ядра клетки к другим местам. Волты, казалось, собирались вокруг проходов, известных как ядерные поры, и, возможно, вписывались в их отверстия. «Это идеальное совпадение», — сказал он Science News в 1996 году.
У Кедерши были свои соображения. Её поразило то, что макрофаги — клетки иммунной системы, похожие на амёб, — обладают наибольшим количеством волтов среди всех клеток человека. Она также вспомнила открытие другой лаборатории, согласно которому слизевики — простые организмы, способные образовывать слизистую массу и ползти по лесной подстилке, — имеют три копии гена MVP, в отличие от одной у человека, что позволяет предположить, что им требуется больше волтов. Она предполагает, что волты играют роль в передвижении клеток, возможно, регулируя экспрессию других белков, которые образуют отростки, помогающие клеткам перемещаться.
Пути Кедерши и Рома разошлись через пять лет после той первой статьи о волтах. Кедерша устроилась в биотехнологическую компанию ImmunoGen, оттачивая свои навыки в фотографировании и характеристике раковых клеток с помощью антител и красителей. Позже она вернулась в академическую среду, чтобы преподавать и работать в лаборатории Пола Андерсона в Бригам-энд-Уименс-хоспитал. Там она открыла ещё один ранее неизвестный компонент клеток, называемый гранулами стресса — цитоплазматические «вихри» матричной РНК (мРНК) и белков, образующиеся, когда клетки сталкиваются с такими проблемами, как истощение энергии или вирусная инфекция. Эти гранулы, которые, по-видимому, сортируют мРНК, чтобы впоследствии их можно было транслировать в белки или разлагать, стали основным направлением научной карьеры Кедерши.
В отличие от этого, Ром полностью сосредоточился на исследовании волтов, отказавшись от других лабораторных проектов. В 2014 году его лаборатория продемонстрировала, что волты образуются необычным образом — с помощью «конвейера» из рибосом. По мере синтеза каждой новой копии MVP нить немедленно накладывается на ранее сформированные, и оболочка волта постепенно формируется, словно модель в биологическом 3D-принтере.
Быстрый процесс сборки означает, что в клетке практически не остаётся свободного MVP, что затрудняет исследование потенциальных функций волтов путём нацеливания на белки и их инактивации. Команда также обнаружила, что MVP не образуют фиксированных химических связей со своими соседями. Вместо этого более слабые нековалентные взаимодействия связывают их, образуя своеобразную решётку. Это позволяет волтам «дышать», открывая промежутки, в которые могут проникнуть относительно небольшие молекулы.
Тем временем другие лаборатории накапливали свои собственные провокационные и сбивающие с толку открытия. В 1996 году европейские исследователи рака, изучавшие белок, который необычно обилен в лекарственно-устойчивых раковых клетках, клонировали ген и обнаружили, что он напоминает ген MVP у крыс. Работая с Валери Кикхофер в лаборатории в Риме, группа затем обнаружила, что лекарственно-устойчивые раковые клетки генерировали гораздо больше волтов, чем неустойчивые, что позволяло предположить, что эти структуры могут удерживать или выводить химиотерапевтические препараты. Но к разочарованию исследователей, остановка производства волтов, или MVP, не повышала восприимчивость клеток к лекарствам.
Клетки строят волты с помощью полирибосомы — по сути, скопления рибосом (синих и жёлтых комплексов), которые одновременно считывают матричную РНК основного белка волта (MVP), продвигаясь от 5’-начала до 3’-конца мРНК. В результате образуется 78 копий MVP, которые выстраиваются в окончательную оболочку волта.
Подчёркивая загадочность волтов, в 2002 году голландская команда вывела из строя ген MVP у линии мышей. У грызунов отсутствовали волты, но они развивались нормально, казались здоровыми, размножались и жили столько же, сколько обычные мыши. Последующее выключение двух других генов белков волта также не повредило мышам. А команда Видигала из NIH недавно деактивировала ген vRNA мыши — только для того, чтобы обнаружить, что эти грызуны тоже не демонстрируют никаких серьёзных изменений, о чём они сообщают в недавнем препринте.
«Патологи не обнаружили никаких проблем ни в одной из проанализированных тканей», — говорит Видигал. «Я никогда не видел случая, когда набор генов был бы исключительно консервативным, высокоэкспрессируемым, создавал огромную структуру, а при их удалении практически ничего не было видно даже на молекулярном уровне. Это безумие».
Ещё в 1987 году лаборатория Рома без труда получила грант от Национального института здравоохранения (NIH) на изучение недавно обнаруженных объектов, причём этот грант получил наивысшую оценку из всех, что он когда-либо получал от этого агентства. Вторая заявка в NIH была одобрена только после двух повторных подач. Третья заявка была наконец одобрена в 1996 году, после трёх попыток, но когда срок её действия истёк несколько лет спустя, агентство отклонило последующие заявки Рома на финансирование исследований волтов. По мере того как NIH начинало уставать от исследований волтов, Ром проявил изобретательность, обратившись за финансированием к Национальному научному фонду, частным фондам, компаниям и другим организациям. Он добился успеха, сосредоточившись не столько на том, что волты могут делать естественным образом, сколько на том, что можно сделать с искусственными.
В 2001 году его лаборатория сообщила о неожиданном открытии: когда они добавили ген MVP крысы в клетки моли, те произвели практически нормальные, но пустые волты. Для формирования структур не требовались три других компонента. Это заставило его задуматься: можно ли использовать эти пустые конструкции в качестве сосудов? В то время Ром, ставший деканом по научной работе медицинского факультета UCLA, помогал разрабатывать университетскую часть нового 100-миллионного проекта по нанотехнологиям, поддерживаемого губернатором Калифорнии, — того, что впоследствии стало CNSI. Получив в своё распоряжение простой способ создания наноконтейнеров, Ром вскоре начал вести переговоры со всеми, кто искал способ доставки ферментов, лекарств или чего-либо ещё в организм. В конце концов, волты уже присутствуют в клетках человека, поэтому Ром утверждает, что они вряд ли вызовут иммунную реакцию, в отличие от сосудов, изготовленных из чужеродных веществ.
Вскоре после этого к числу сторонников волтов присоединился иммунолог-онколог из UCLA Стивен Дубинетт. Он был пионером в применении терапии CCL21 при лечении рака, основываясь на данных о том, что этот белок стимулирует пролиферацию иммунных клеток и другие иммунные реакции. Первоначальная стратегия Дубинетта заключалась в инъекции CCL21 непосредственно в опухоли. Это вызывает сильный противоопухолевый иммунный ответ, но он кратковременный. В надежде избежать повторных инъекций его лаборатория искала более долговечные подходы, такие как модификация собственных клеток пациента для производства CCL21. Ром предложил, возможно, более простое решение: поместить CCL21 внутрь волтов, откуда он мог бы медленно вытекать.
В настоящее время существует несколько способов добавления молекул внутрь синтетических волтов, но Кикхофер разработал метод, который стал наиболее предпочтительным. Один из белков внутри волтов, VPARP, имеет домен под названием INT, который связывается с обращённой внутрь частью MVP. Когда Кикхофер присоединил INT к другим белкам, добавив соответствующую ДНК в их гены, модифицированные молекулы проникли в пустые волты.
Более десяти лет назад одна биотехнологическая компания приобрела у UCLA лицензию на разработки Рома, надеясь использовать волты для доставки противораковых препаратов. Однако она отказалась от этой идеи, и в 2013 году UCLA вернула себе права на интеллектуальную собственность, после чего Ром основал компанию Vault Pharma, чтобы самостоятельно реализовать эту стратегию с использованием CCL21 и других потенциальных препаратов. Но в 2018 году поглощение компании нанесло ей сокрушительный удар. Vault Pharma сотрудничала с компанией Protein Sciences в разработке коммерческого процесса производства заправленных лекарством волтов в клетках насекомых. Но за несколько недель до запланированного начала производства волтов CCL21 компанию Protein Sciences купила фирма, которая практически не была заинтересована в проекте, и доступ к волтам внезапно был перекрыт.
На восстановление ушли годы, говорит Оливер Фоллмер, генеральный директор Vault Pharma. С помощью Кикхофер, которая сейчас находится на полупенсии, Vault Pharma разработала, пожалуй, более простой и эффективный способ массового производства волтов в соответствии со стандартами клинических испытаний. Они добавляют человеческий ген MVP и ген желаемого груза, модифицированный для включения INT, в дрожжевые клетки, чтобы загруженные волты производились за один проход. «Теперь мы можем производить волты граммами, а может быть, и килограммами», — говорит Ром.
Тем не менее, компании Vault Pharma по-прежнему необходимо привлечь около 10 миллионов долларов для проведения клинических испытаний препарата CCL21 для лечения рака. По словам Фоллмера, это исследование имеет решающее значение для подтверждения безопасности препарата Vault и обеспечения дальнейшего существования компании. «Мы находимся в „долине смерти“», — объясняет он, имея в виду тот опасный этап, когда биотехнологический стартап с иссякающими средствами должен продемонстрировать значительный прогресс в клинических испытаниях, чтобы выжить. На фоне общего спада инвестиций в биотехнологии венчурные фонды, крупные фармацевтические и вакцинные компании неохотно берутся оплачивать расходы на клинические испытания.
Не теряя надежды, Ром размышляет о других возможностях для CCL21. Одна из них — помощь в преодолении серьёзного препятствия на пути генной терапии. Эта стратегия часто опирается на обычно безвредные вирусы, известные как аденоассоциированные вирусы (ААВ), для доставки терапевтических генов. Но ААВ трудно нацелить на отдельные ткани. Хуже того, AAV часто не работают, потому что многие люди — по одним оценкам, 40% — уже подвергались воздействию этих вирусов естественным путём и вырабатывают антитела, нацеленные на них. «Предварительно сформированный иммунитет кажется настоящим препятствием», — говорит Дэвид Куриэль, исследователь в области генной терапии из Вашингтонского университета в Сент-Луисе. И даже у пациентов, у которых не обнаруживается антител к AAV, могут возникнуть опасные, даже смертельные иммунные реакции, если врачи используют высокие дозы вируса, чтобы обеспечить достаточную доставку гена.
Несколько лет назад Куриэль и его аспирант Логан Коллинз обсуждали способы «скрытой» доставки ААВ в клетки пациента, когда Коллинз вспомнил, что читал о волтах. «Возможно, это было в средней или старшей школе, может быть, на Википедии», — говорит он. «Я был так очарован их способностью удерживать материалы наподобие контейнеров». Прикрепление молекул-мишеней, таких как антитела, к внешней поверхности волтов также может позволить направлять их в определённые ткани.
Куриэль тоже слышал о волтах, и Коллинз предложил попробовать втиснуть ААВ в один из них. Однако эта идея оставалась нереализованной, пока Куриэль не связался с Ромом примерно через два года. Ром тоже давно думал, что волты могут служить вектором для генной терапии или переносить мРНК для вакцин — например, заменяя липидные наночастицы в вакцинах от COVID-19. Но у него и других учёных возникали проблемы с тем, чтобы заставить синтетические волты удерживать ДНК или РНК длиной в один ген.
Во время чата в Zoom Ром рассказал Коллинзу и Куриэлю о волтах, а они, в свою очередь, описали потенциальный способ заставить вирус закрепиться внутри структуры: «молекулярный клей», ранее разработанный лабораторией Куриэля. Коллинз использовал его, чтобы прикрепить INT к поверхности ААВ, чтобы они зацепились за MVP внутри волтов. Затем он смешал вирусы с раствором синтетических волтов, которые Ром прислал из UCLA.
Как сообщила команда в препринте, впервые опубликованном в ноябре 2023 года, этот удивительно простой план сработал. При определённых условиях один или два вируса ААВ проникали в волты и оставались там. А когда эти волты вводились в клетки, вирусы высвобождали свой генетический груз, позволяя ему экспрессироваться. Что не менее важно, когда клетки оказывались в окружении антител, нацеленных на ААВ, волты проскальзывали мимо них, словно самолёт-невидимка. Куриэль считает, что у этой тактики есть реальные шансы решить проблему иммунитета к AAV.
Другие исследователи в области генной терапии с использованием AAV считают этот подход дерзким, хотя и предварительным, учитывая, что команда ещё не продемонстрировала, что вирусные волты работают на животных. «Это очень хорошая, креативная стратегия», — говорит Сельваранган Понназаган из Университета Алабамы в Бирмингеме, который изучает AAV-терапии рака и других заболеваний.
Марк Кей из Стэнфордского университета согласен с этим. «Я всегда задавался вопросом, что происходит с волтами», — добавляет он. Но он и другие исследователи в области генной терапии с использованием ААВ отмечают, что десятки лабораторий и компаний работают над другими подходами, некоторые из которых продвинулись дальше в преодолении проблемы антител к ААВ.
«В классическом учебнике по клеточной биологии „Молекулярная биология клетки“ ни в одном из семи изданий, выходивших на протяжении 40 лет, не упоминаются волты», — отмечает клеточный биолог из Калифорнийского университета в Сан-Франциско Брюс Альбертс, один из первых авторов и нынешний соавтор книги (а также бывший главный редактор журнала Science). Альбертс не сомневается, что волты могут играть какую-то жизненно важную роль, возможно, выполняя какую-то очень специфическую функцию, которую трудно воспроизвести в лабораторных условиях. «Например, волты могут быть частью масштабной войны с вирусами, позволяя клеткам и организмам выживать при воздействии вирусов, о которых мы пока ничего не знаем», — говорит он. Но Альбертс отмечает, что он и соавторы учебника не любят перегружать студентов неизвестными фактами, поэтому волты не вошли в книгу.
Кедерша считает это упущение «печальным». Даже несколько абзацев о загадке волтов в этом известном труде могли бы вдохновить читателя на поиск решения. «Наука — это не сборник фактов, это процесс», — говорит она. Но она не слишком беспокоится по этому поводу. Обнаруженные ею гранулы стресса включены в учебники. «Это уже победа», — смеётся она.
Что касается Рома, он не жалеет о том, что посвятил карьеру погоне за тем, что некоторые могут считать «белым китом». У него всё ещё есть список из примерно полудюжины потенциальных функций волтов, которые его интригуют. И он допускает ещё одну возможность: возможно, они ничего не делают. Вместо этого они могут быть просто тем, что он называет «камнями», — запасами аминокислот, которые клетка может добывать в случае необходимости. (Каждая MVP содержит более 800 аминокислот.)
В надежде вдохновить новое поколение волтологов — и почерпнуть ещё несколько идей — в начале этого года он запустил серию онлайн-видео. На своём YouTube-канале «The Vault Guy» Ром сочетает шутки и мультяшную анимацию с серьёзными обсуждениями научных методов, финансирования и публикаций. На сегодняшний день у канала почти 100 видео и 2 тысячи подписчиков, так что сериал не стал вирусным. Но среди зрителей может оказаться тот самый человек, который наконец разгадает эту великую загадку.
«Оптимист во мне верит, что ещё до моей смерти кто-то разгадает, как устроены волты», — говорит Ром.